電圧イメージングによりヒト乳がん細胞の動的な電気的特徴が明らかに

May 16, 2023

Communications Biology volume 5、記事番号: 1178 (2022) この記事を引用

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がん細胞は、正常細胞と比較して脱分極した静止膜電位 (Vm) を特徴とし、病態生理学的挙動に直接関与する活性イオンコンダクタンスを発現します。「興奮性」組織との類似性にもかかわらず、がん細胞の Vm 動態についてはほとんど知られていません。今回のハイスループットの細胞分解能 Vm イメージングにより、いくつかの乳がん細胞株では非がん性 MCF-10A 細胞と比較して Vm が動的に変動することが明らかになりました。私たちは、数百のヒトトリプルネガティブ乳がん MDA-MB-231 細胞の Vm 変動を特徴付けます。教師なし機械学習プロトコルを通じて動的電気信号 (DES) を定量化することにより、「ノイズが多い」から「点滅/波打つ」までの 4 つのクラスを特定します。MDA-MB-231 細胞の Vm は、 MCF-10A 細胞の Vm は比較的静的ですが、上皮細胞の標準的誘導因子であるトランスフォーミング成長因子 β1 による処理後に変動が増加します。これらのデータは、Vm 変動を生成する能力がハイブリッド上皮間葉細胞または管腔前駆細胞に由来する細胞の特性である可能性があることを示唆しています。

体内のすべての細胞は、遺伝子発現、分泌、細胞全体の運動性などの幅広い機能を調節する原形質膜間に電位差 (Vm) を示します。静止時の細胞の Vm は、細胞タイプ間および細胞タイプ内で異なります。興味深いことに、これはおよそ 1 年です。神経や筋肉などの成熟「静止」細胞では-70 mVですが、がん細胞や幹細胞などの増殖細胞では顕著に脱分極します（Vm ca. -50 ～ -10 mV）1,2。

Vm は、活動電位の生成と伝導をサポートする心臓、筋肉、神経などの古典的に興奮しやすい組織において、自発的および刺激に応答して劇的に変動します。いくつかの細胞タイプの静止時 Vm は変動することが示されています 3。これらには、呼吸 4、動脈血管運動 5、生物学的「時計」6、睡眠 7,8 を制御するニューロンなど、リズミカルな活動を持つ細胞が含まれます。 Vm の振動は、てんかんや神経変性などの病態生理学的状況にも現れ、ネットワーク効果にまで及ぶ可能性があります 9,10。

いくつかの癌腫では、電位依存性ナトリウムチャネル (VGSC) の機能的発現が転移プロセスを促進します 11。 VGSC ブロッカーで癌細胞を in vitro で治療すると、3D 浸潤が部分的に抑制されます 12,13。 VGSC の最も特異的な阻害剤はテトロドトキシン (TTX) であり、チャネルが開いた状態にあるときにチャネル孔内の部位に結合することでチャネルをブロックします 14。 TTX は in vitro で癌細胞の浸潤を減少させますが、この効果は in vivo で VGSC Nav1.5 の siRNA サイレンシングによって無効になります 12、13、15、16。グラデクら。らは最近、SIK1 のサイレンシングが Nav1.5 の発現、浸潤、および上皮間葉転換 (EMT) 関連転写因子 SNAl117 の発現を誘導することを実証しました。しかし、上で述べたように、正常上皮と比較したヒト乳がん細胞の定常状態の静止 Vm は強く脱分極しています 18。悪性度の高いトリプルネガティブ乳がん（TNBC）由来の MDA-MB-231 細胞の場合、Vm は -40 ～ -20 mV の間にあります 15、19、20。 VGSC の Vm 依存性不活化は、チャネルの大部分がそのような脱分極した膜電位で永久に不活化されるはずであり、したがって TTX に対して非感受性であることを意味します。それにもかかわらず、TTX は、持続的なウィンドウ電流を遮断することによって、これらの細胞およびいくつかの他の癌腫の浸潤を阻害することが繰り返し示されています 11、15、19、21、22、23、24。

90%, 91/100) of high signal-to-noise ratio, large amplitude (>∣1.5%∣ΔR/R0) events were negative-going ("−VE", Fig. 3b). Therefore, subsequent analyses focus on the −VEs (Fig. 2a, b). Most cells exhibited few or no fluctuations, but a subset of cells was highly active (Fig. 3c, see also Supplemental Movie 1). Among the active cells, events were detected at an average frequency of 2 ± 0.2 events/cell/1000 s (n = 20 coverslips, Fig. 3d)./p> 2.5× of their within-ROI pixel standard deviation from the median pixel value, and if also free of imaging artefacts including floating dust, mechanical vibration, and illumination edge effects. b Visual inspection of each cell’s time series finalized admission to the cellular DES pipeline. c 22 features relevant to time series temporal patterns were extracted from each time series using the Catch-22 algorithm32 and normalized with a Box-Cox transformation relative to their values. d The silhouette coefficients for different cluster numbers were generated through hierarchical clustering (blue) or gaussian mixture modeling (GMM, orange) on the normalized features./p>

t0 and t < t0 equally). These filter-normalized time series were then divided, blue frames by green frames, to find the ratio image for each time point (Fig. 3a). Cells were segmented using CellPose62, using the default cytoplasmic segmentation model and approximate cellular diameter of 30 pixels. Additional segmentations of active cells that the Cellpose network did not identify were added by hand. The segmented ROIs were eroded with a single (1-round of binary) before extracting the ROI time courses to suppress the effects of movement at the cell edges. For each eroded ROI, we calculated the median of the pixel values at each time point. The mean of the time courses was subtracted and offset so that they were symmetric at about 1./p>

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